PCR試驗試劑與耗材對檢測質(zhì)量：

在PCR檢測質(zhì)量控制中，試劑的選擇具有十分重要的作用，也是實驗人員為關(guān)注的檢測質(zhì)量控制因素。試劑一定選擇質(zhì)量和信譽好的**，一但選定后不要輕易改換。如果必須改換時應與原產(chǎn)品進行嚴格比對試驗，包括敏感性、特異性、試劑保存期等試驗。并且經(jīng)常要注意不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異。比如說TaqDNA聚合酶，不同廠家**的質(zhì)量是有差異的，盡管都是標出相同活性單位，但其標定方法和保存液的成分以及運輸過程的不同常常導致實際活性單位是有差異的，有時由于其活性低，使得弱陽性樣品漏檢；有時由于其活性過高出現(xiàn)非特異擴增。這與ELISA檢測中酶結(jié)合物的作用相似。其實影響PCR檢測結(jié)果的試劑很多，可以這樣說，PCR檢測用的所有試劑都可能影響檢測效果?？刂圃噭┑馁|(zhì)量是作好PCR檢測前提。我們認為：是選擇PCR試劑盒來控制試劑質(zhì)量。

評價一種PCR試劑盒，除了考慮它的敏感性、特異性、穩(wěn)定性、操作簡便程度外，還應包括：試劑盒提供的試劑覆蓋整個PCR檢測試驗的程度。如果試劑盒提供了整個PCR檢測試驗的試劑，表明該試劑盒對PCR檢測試驗的試劑具有了全程控制性能。相反，PCR檢測的試劑的質(zhì)量控制程度比較低，意味著檢測質(zhì)量可控程度低。例如：溴化乙錠僅僅起熒光染料的作用，如果在陽光下長時間的照射下失效了，在紫外燈下發(fā)熒光效能降低，可能會造成一些弱陽性樣品的漏檢，出現(xiàn)假陰性。其它試劑出現(xiàn)問題也是一樣影響檢測質(zhì)量。試劑盒在**過程中，有一套試劑**質(zhì)量控制體系。每一試劑組分都經(jīng)過靈敏度、敏感性、特異性質(zhì)量控制的檢測，在有效期內(nèi)能確保每種試劑的質(zhì)量。因此，選擇試劑盒進行PCR檢測是比較理想的控制方法。在PCR檢測中，全部使用試劑盒提供試劑，對PCR檢測質(zhì)量控制有益。

實驗耗材也是影響PCR檢測質(zhì)量的因素之一。PCR反應管薄厚以及傳導熱量性能等直接影響PCR檢測效果。在熱蓋PCR儀上一般不需要加入礦物油，但有些PCR反應管蓋子不嚴密，導致擴增過程中反應液水份蒸發(fā)，嚴重影響檢測靈敏度。PCR反應體系是微量的，移液器的Tip頭**質(zhì)量不好時，有時致使液體殘留量多或洪吸作用強，導致試劑盒中試劑量不夠，配置PCR反應體系不準，造成檢測質(zhì)量下降。

在每次PCR檢測時，一定設立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提取（RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。因此，每次試驗都應設立表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴增和電泳鑒定對照，只有設立試驗全程的對照，才能證明試驗結(jié)果成立。這一點對PCR和RT-PCR檢測試驗是非常重要的。

陽性對照在試劑盒中是必須有的組分。設立陽性對照有3種類型：第1種是用檢測的病原微生物作為陽性對照。這樣的直接對照優(yōu)點是直觀、準確、本次試驗完整條件對照，可以說明此次試驗是否成立。缺點是對檢測過程中增加了PCR污染的指數(shù)。另外，不能表明每個檢測樣品對照成立。第2種是設立一種與檢測病毒無關(guān)微生物作為陽性對照。優(yōu)點是降低了PCR污染的危險性，并且提高了試劑盒的生物安 全性。缺點是僅是參考陽性對照，不夠直接、完全反映本次試驗成立，也不能表明每個檢測樣品對照成立?？蛇m合怕污染的實驗室或要求生物安 全等級高的病原微生物的檢測。第三種是在每個反應管內(nèi)設立參考對照，除了陽性擴增帶之外，又設立一條擴增帶，指示每個反應管內(nèi)檢測情況。檢測為陽性時出現(xiàn)兩條不同大小擴增帶，陰性時出現(xiàn)一條擴增帶。這種對照設立技術(shù)要求高，成本也高些，對照效果是理想的，可以排除每個檢測樣品操作失誤或試劑出現(xiàn)問題對檢測造成的影響。由于在一個反應管內(nèi)對兩條模板同時進行擴增，相互之間多少有一定的干擾，因此，對病原微生物檢測靈敏度或多或少有一定影響。此種對照方式可能會成為PCR對照的發(fā)展趨勢。